心房颤动（Atrial Fibrillation），简称房颤，是一种常见的心律失常，成人患病率2%~4%^［1］，且逐年增加^［2］.房颤导致高达20%的缺血性卒中^［3］，是卒中的最大危险因素之一.在我国的临床实践中，目前常使用CHADS₂和CHA₂DS₂⁃V_ASc评分来评估房颤患者的卒中风险.然而，现有的卒中评分都只考虑临床因素，积极寻找能早期预测房颤相关缺血性脑卒中的标志物，将有助于及早干预治疗，阻碍病情发展，改善预后.

长链非编码RNA（long non⁃coding RNA，lnc⁃RNA）是转录本长度超过200核苷酸且不具备编码蛋白质功能的一类RNA.lncRNA的表达异常在多种心血管疾病的发生发展中发挥关键作用.lncRNA ANRIL在多项人类全基因组关联研究中被确定为动脉粥样硬化风险和心血管事件最可靠的预测因子^［4］，但是目前尚无有关lncRNA在房颤伴卒中患者中表达水平的报道.

本研究首次通过高通量测序技术构建房颤伴卒中外周血单核细胞的lncRNA差异性表达谱，并通过生物学功能分析及构建lncRNA⁃miRNA网络，为从分子水平阐明房颤卒中的发生发展机制提供理论依据，并寻找能够预测房颤患者发生卒中的新型生物标志物.

选取2019年11月就诊于泰州市人民医院心内科确诊为房颤卒中患者15例为实验组，所有患者均为首次发作脑卒中；同期另选15例确诊为房颤患者为对照组.取其中各三例进行基因芯片检测，余留取PCR验证.两组患者均为单纯持续性房颤，性别、年龄等无统计学差异（如表1所示）.患者均已排除恶性肿瘤、急性感染及全身免疫性疾病、甲状腺疾病、严重的贫血、各种器官移植和严重的心、肝、肺、肾功能不全等疾病史.研究已获得泰州市人民医院伦理委员会批准通过（伦理批号：KY202022201），受试者均知情并已签署同意书.

于入院24 h内以无菌注射器采集外周血20 mL，肝素抗凝，将抗凝血与等体积的磷酸盐缓冲液（PBS）混匀后，按1∶1体积比缓慢加入淋巴细胞分离液，用密度梯度离心法分离单核细胞，-80 ℃冻存.

使用Trizol试剂（美国Invitrogen公司）提取外周血RNA，并使用Rneasy Mini Kit（德国QIAGEN公司）纯化.提取的RNA使用Nano Drop ND⁃2000分光光度计（美国Thermo公司）测定260，280 nm的吸光度（A）值，计算A₂₆₀/A₂₈₀来确定样本RNA的浓度和纯度，A₂₆₀/A₂₈₀取值1.9~2.1，越接近2.0纯度越高.提取样品总RNA并使用ribo⁃zero试剂盒（美国Illumina公司）消化核糖体RNA，操作过程按照试剂盒说明书进行.

在纯化的RNA中加入打断试剂将RNA打断成短片段.以打断后的RNA为模板，用逆转录试剂盒将RNA片段逆转录成cDNA片段，cDNA片段末端修复，连接测序接头然后进行片段大小选择，最后进行PCR扩增.构建的RNA文库用Bioanalyzer 2100 RNA⁃6000 Nano Kit（美国Aglient公司）检验合格后，使用

Illumina测序仪进行测序.

对高通量测序中产生的原始数据（Raw Reads）使用Trimmomatic^［5］软件进行质量预处理，获得有效数据.利用hisat2^［6］将Clean Reads与人参考基因组（UCSC HG19）进行序列比对，获取在参考基因组或基因上的位置信息以及测序样本特有的序列特征信息.使用

htseq⁃count^［7］软件获取每个样本中比对到蛋白编码基因上的数据，cufflinks^［8］软件计算蛋白编码基因的表达量FPKM（fragments per kilobase of

exon model per million mapped reads）作为持续性心房颤动伴卒中组及持续性心房颤动不伴卒中组的lncRNA/mRNA谱.应用DESeq软件包对两组样本的转录本表达水平进行差异计算，获得P及差异倍数（Fold Change，FC），t检验分析后获得两组的差异lncRNA/mRNA表达谱（Fold change≥2，P<0.05）.

应用DAVID（Data Base for Annotation，Visualization and Integrated Discovery）在线工具对各部分基因进行Gene Ontology（GO）功能分析和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路分析，P<0.05为显著富集的阈值.对于总的差异lncRNA的富集结果，按照P排序，提取P较小的前300个miRNA⁃lnc⁃RNA相互作用对，利用Cytoscape软件（3.9.0版本）绘制lncRNA⁃miRNA靶标互作网络图.

对表达差异最大的基因LINC01002和HCG18进行qRT⁃PCR验证.对提取后的RNA进行逆转录获取cDNA用于qRT⁃PCR.将1 µL cDNA添加到10 µL Blataq qPCR Master Mix（abm公司，加拿大）、8 µL DEPC处理水和0.5 µL反向和正向引物中.cDNA在ABI 7500实时PCR系统（美国Applied Biosystems）上扩增40个循环.使用的引物序列分别为TCTCCAGGCTGATCTCAA（F）/GTTACCTCCTG⁃GGACCCTT（R）以及TGAGCCTCCCAGTT⁃CATGTT（F）/TCCTGCTGACTTGTCCACAT（R）.qRT⁃PCR的反应条件：95 ℃反应3 min，95 ℃反应15 s，60 ℃反应1 min，40个循环.GAPDH为内参基因，数据处理采用△Ct（Cycle Threshold，循环阈值）法计算结果：

使用Graph Prism8软件绘图.

应用RNA⁃seq技术共检测出27377条lncRNAs.与对照组相比，房颤伴卒中组患者差异表达301条，其中上调143条，下调158条（图1），上调和下调表达差异最大的是LINC01002，HCG18等（如表2所示）.

对两组中表达差异的基因进行GO功能分析发现，差异表达基因参与疾病发生发展最主要的生物学过程包括结合、肽交联、高渗反应、内肽酶活性的调节、细胞体积的正向调节等；最主要的细胞组成为Cdc73/Paf1复合物、细胞质核糖核蛋白颗粒、粟粒化包膜、蛋白酶体复合体、细胞核等；最主要的分子功能包括表皮结构构成、与物质的跨膜运动相关的ATP酶活性、钠钾氯化合物同向转运体活性、铵跨膜转运体活性、内肽酶抑制剂活性等（图2a）.

对差异表达的基因进行KEGG分析后发现，差异表达的lncRNA相关信号通路主要与信号转导、免疫系统、炎症、细胞生长和死亡和信号分子相互作用等相关（图2b）.其中LINC01002可以通过脂肪消化吸收、醚类脂代谢、鞘磷脂代谢、甘油脂代谢、甘油磷脂代谢、磷脂酶D信号传导途径、胆碱代谢等途径发挥作用（如表3所示）.

利用R network软件包绘制lncRNA⁃miRNA靶标互作网络图（图3），结果显示XLOC_005045，XLOC_006945，XLOC_013107，XLOC_001139，XLOC_004677是共表达网络中结合节点最多的前五个lncRNAs，同时具有作为疾病的生物标志物的潜力.hsa⁃miR⁃619⁃5p是共表达网络中与lnc⁃RNAs作用最多的节点，提示hsa⁃miR⁃619⁃5p在持续性房颤并发卒中的发病机制中可能起关键作用.而上下调差异表达最大的基因LINC01002，HCG18则分别通过调节miR⁃1285⁃3p，miR⁃1229⁃3p的靶基因来促进持续性心房颤动患者中卒中的发生发展.

对上调和下调最大的LINC01002和HCG18进行验证，结果显示所验证基因在两组人群中差异表达具有统计学意义（均为P<0.001）（如图4所示），验证结果与全转录组测序结果一致.

房颤是一种常见的心律失常，其引起的卒中在我国成人缺血性卒中发病中高达30%，已成为成人致死、致残的重要原因之一^［9-10］.临床上主要采取CHA₂DS₂⁃VaSc评分评估房颤患者发生血栓栓塞及卒中的可能性，并对评分高于2分（男性）/3分（女性）的患者人群进行及早的干预.然而仍有相当部分的患者经过评分干预后仍然发生缺血性卒中事件.Go et al^［11］研究发现房颤负担与卒中风险之间存在关联，而这与CHA₂DS₂⁃V_ASc评分无关.Botto et al^［12］报道在安装了起搏器的房颤患者中，房颤持续时间与卒中风险之间存在类似关系，低CHADS₂评分的患者在任何水平的房颤持续时间均表现出较低的卒中风险，而CHADS₂评分高的患者则相反.

长链非编码RNA（long non⁃coding RNA，lnc⁃RNA）是转录本长度超过200个核苷酸且不具备编码蛋白质功能的一类RNA.lncRNA的表达异常与人类疾病直接相关，lncRNA调节回路的失调与心脏病理性肥大、血管疾病、动脉粥样硬化、血脂异常和代谢综合征等诸多疾病有关.Ruan et al^［13］通过房颤患者的lncRNA表达谱发现，与健康

人群相比，房颤患者中分别有156和63个lnc⁃RNAs分别上调和下调.Cao et al^［14］发现Lnc⁃RNA PVT1在房颤人群中过表达，并通过miR⁃128⁃3p⁃SP1⁃TGF⁃β1⁃Smad轴促进房颤中的心房纤维化，从而在房颤的发生发展中发挥一定的作用.此外，Yang et al^［15］研究发现在中国汉族人群中，缺血性卒中患者的lncRNA ANRIL表达比正常人明显增加（P=0.002），而CDKN2A表达明显降低（P<0.001），说明其可能在缺血性脑卒中的病理过程中发挥一定的作用.Roberts et al^［8］则通过对脑卒中人群lncRNAs的测序发现，lnc⁃RNA⁃ENST00000568297，lncRNAENST00000⁃568243和lncRNA⁃NR_046084在缺血性脑卒中和正常人群之间表现出明显的差异性表达（均为P<0.05），在进行lncRNA⁃miRNA⁃mRNA调控网络后发现，lncRNA可能通过调控关键的

miRNA，mRNA或其他相关途径参与缺血性脑卒中的病理生理学.

为研究预测房颤患者并发脑卒中的潜在生物标志物，本研究通过高通量测序技术对房颤伴发卒中与不伴卒中人群进行了lncRNA表达谱检测，并作生物功能学分析.结果显示，与对照组相比，房颤伴卒中患者差异表达301条lncRNA，其中上调和下调表达差异最大的是LINC01002，HCG18等.此前，Fu et al^［16］发现在阵发性血红蛋白尿病人中LINC01002在疾病CD59细胞中明显增高，并说明其可能参与CD59细胞增殖过程.Xu et al^［17］通过构建ceRNA网络的方法研究发现LINC01002通过与hsa⁃let⁃7f⁃5p家族竞争性结合来影响缺血性卒中靶基因的表达，但在qRT⁃PCR验证中并未发现其在缺血性卒中和健康人群表达的差异.而本研究通过qRT⁃PCR验证发现和单纯房颤患者相比，LINC01002在缺血性脑卒中患者中明显高表达，分析后认为这可能是因为LINC01002仅在持续性心房颤动伴发卒中人群中异常高表达.通过KEGG分析还发现LINC⁃01002可以通过脂肪消化吸收、醚类脂代谢、鞘磷脂代谢、甘油脂代谢、甘油磷脂代谢、磷脂酶D信号传导途径、胆碱代谢等途径发挥作用.同时，通过构建lncRNA⁃miRNA网络，可以发现LINC⁃01002通过调节miR⁃1285⁃3p的靶基因来促进心房颤动患者卒中的发生发展，因此LINC01002可以作为预测房颤患者发生卒中新型生物学标志物.Gu et al^［18］研究发现在烟雾病患者群体中，HCG18可与发挥核心调控作用的miR⁃423⁃5p产生竞争，以发挥其作用.而本研究通过构建lnc⁃RNA⁃miRNA网络发现HCG18通过调节miR⁃1229⁃3p的靶基因来促进房颤患者卒中的发生发展.

由于本研究的样本量较少，所以还需要对外周血单核细胞lncRNAs的差异表达进行大样本的临床验证，并与健康人群中的lncRNAs表达水平进行比较.同时，也需要进一步研究差异基因靶向调控机制，联合相关实验研究，以进一步明确其在房颤伴发脑卒中发生发展中的作用.

本研究应用RNA⁃seq技术构建房颤伴卒中与不伴卒中患者的lncRNA/mRNA差异性表达谱，通过生物学功能分析及构建lncRNA⁃miRNA网络，为房颤伴发卒中的发生发展机制提供基因水平的理论依据.同时，还发现LINC01002，HCG18在房颤伴卒中患者人群中分别异常高表达、低表达，可作为该病的潜在生物学标志物.