土壤可提供固碳、促进生物地球化学循环和生物多样性等生态系统服务，为这些服务提供动力的重要引擎是土壤微生物，土壤微生物群落组成的改变可以影响土壤养分循环，进而影响作物生长［7］.土壤微生物的功能严重受制于土壤物理和化学条件，例如，土壤团聚体的孔隙空间结构和水文特性会影响微生物的代谢速率和有机物分解［8］.进入土壤的微塑料会对土壤系统产生影响，现有研究发现微塑料可以在土层中迁移［9］，并影响土壤容重、持水能力、微生物活性及水稳定性团聚体［10］.微塑料对植物毒性的研究发现微塑料可降低黑麦草发芽率［11］，影响作物生物量、组织元素组成和根系性状［12］.但是现有研究多是短期且实验室研究，还缺乏实际野外环境植物全生命周期的研究.
因此本研究利用野外lysimeter系统，探讨实际环境中微塑料对小麦生长、土壤理化性质和土壤微生物的影响，为微塑料在土壤生态系统中的风险评估提供研究支撑.
1 材料与方法
1.1 微塑料及试验农田概况
实验所用红色荧光聚乙烯微球购自美国Cospheric，产品ID为UVPMS⁃BRO⁃995，密度0.995 g·cm-3，粒径10~45 μm，激发波长607 nm，发射波长575 nm.
选择江苏省农业科学院六合动物实验基地（32°29′N，118°36′E）的野外lysimeter进行试验.基地所在地属北亚热带季风湿润气候区，年平均气温15.3 ℃，年平均降雨量970 mm，年日照2200 h，无霜期215 d，该区主要为稻麦两熟制.供试土壤属黄棕壤发育的马肝土，质地为重壤土，其1~20 cm土壤的基本性状：pH 6.4（水土比为2.5∶1，mL∶g），全碳10.3 g·kg-1，总氮1.1 g·kg-1，总磷0.17 g·kg-1，总钾8.84 g·kg-1，有效磷0.46 mg·kg-1，速效钾47.6 mg·kg-1.
Lysimeter系统建于2017年，用1 cm厚的PE（polyethylene）板制成高74 cm、直径30 cm的圆筒，将事先砌成的高50 cm、内径略大于30 cm的原状（未扰动）土柱嵌入圆筒，底部垫4 cm细沙，PE板封闭圆筒底部.每个土柱垂直纵向安装四根水体采样管，分别位于地上0和8 cm以及地下30和50 cm，各自用于采集麦季地表径流、稻季径流、渗滤液和底层渗滤液.
取土柱表层（0~15 cm）土，晾干敲碎后加入荧光聚乙烯微塑料，拌匀后将土回填至土柱中，分别得到空白对照组（CK）、低浓度微塑料处理组（L）和高浓度微塑料处理组（H），浓度分别为0，147，782 mg·kg-1，每个处理组三个平行.以小麦（宁麦22）为供试植物，于2019年11月下旬播种，采用穴播的方式种植，总共施用22.5 g·m-2复合肥，田间管理与大田一致.
1.2 植物和土壤样品的收集和分析测定
小麦成熟期采集地上部植株和0~40 cm土柱，小麦经自然晾晒风干后采集籽粒和秸秆，称重计算生物量.耕作层土壤（0~10 cm）自然风干后，研磨过80目筛.土壤用去离子水（水土比2.5∶1，mL∶g）浸提，震荡5 min后静置30 min，用pH计（Orion⁃3Star，Thermo）测定水和沉淀界面的pH.土壤阳离子交换量（CEC，cation exchange capacity）使用三氯化六氨合钴浸提分光光度法.土壤有机质采用重铬酸钾外加热法.土壤全氮含量使用过硫酸钾消化法.土壤全磷有效磷含量使用钼锑抗比色法.土壤磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法测定，其活性以24 h后每克土壤中P2O5的毫克数表示.0~40 cm的土柱经自然风干后，采用湿筛法，以10 cm为间隔，用组筛（60，30，18，6 mesh）测定水稳定性团聚体.部分耕作层土壤进行16S测序，测定土壤微生物.
1.3 土壤微生物的测定
根据E.Z.N.A.®soil试剂盒（Omega Bio⁃tek，Norcross，GA）说明书进行总DNA抽提.DNA浓度和纯度利用NanoDrop2000（Thermo Scientific，Wilmington）进行检测，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量.使用引物338F （5′⁃ACTCCTACGGGAGG⁃CAGCAG⁃3′）和806R （5′⁃GGACTACHGGGTWTC⁃TAAT⁃3′）对微生物16S rRNA的V3⁃V4区进行PCR扩增.PCR反应条件如下：95 ℃，3 min，27个循环；循环包括95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s；循环结束后72 ℃ 10 min.扩增结束后，使用2%琼脂糖凝胶电泳检测提取PCR产物，产品纯化使用AxyPrep DNA胶提取试剂盒（Axygen Biosciences，Union City，CA），最后由上海美吉生物医药科技有限公司利用Illumina Miseq平台进行高通量测序.
原始数据序列使用Trimmomatic软件质控，使用FLASH软件进行拼接，使用UPARSE软件（http：∥www.drive5.com/uparse/）根据97%的相似水平对有效序列进行OTU（operational taxonomic units）划分，生成OTU表，使用UCHIME软件剔除嵌合体.为了得到每个OTU对应的物种分类信息，采用RDP classifier（https：∥sourceforge.net/projects/rdp）对OTU代表序列进行物种分类注释，默认置信度阈值0.7.
对土壤微生物群落结构和土壤养分指标进行冗余分析（RDA），同时为评估微生物与土壤养分指标之间的相关性，对目水平的丰度在前20的微生物和七种土壤养分指标进行spearman相关性分析.
1.4 数据分析
所有数据采用SigmaPlot 12.5软件进行分析，试验结果表示为平均数±标准误差（Mean±SDE），进行单因素方差分析，检验不同处理组之间的差异程度，进行相关数据的统计分析，p<0.05被认为是差异显著.
2 结果与分析
2.1 微塑料对小麦生物量的影响
种植194 d后，收获小麦秸秆和籽粒生物量如图1所示.结果显示不同浓度微塑料处理条件下小麦秸秆和籽粒的生物量均无显著差异.与本研究相似，陈熹等研究分子质量为2000 D的聚乙烯微塑料对小麦农艺性状的影响发现，不同累积量处理（0.042，0.212，0.424，2.121，4.241 g·kg-1）对小麦株高、穗长、有效穗、小穗数、穗粒数、穗粒重和千粒重无显著影响［13］.但是，廖苑辰等［14］研究聚苯乙烯微塑料对小麦的影响发现，5 μm的微塑料在10 mg·kg-1时小麦根长和株高下降最显著，而当暴露量达到100 mg·kg-1时，微塑料对小麦的生长无显著影响，表明微塑料对小麦的植物毒性与暴露浓度相关，毒性与浓度不存在正相关性.此外，研究表明微塑料的生物效应与微塑料种类、大小和形状有关系［15］.De Souza Machado et al［12］研究不同类型的微塑料对葱的效应，发现聚酯纤维和聚苯乙烯显著增加了根的生物量，但高密度聚乙烯颗粒却没有，表明形状或聚合物类型的不同对生物的影响也不同.陈熹等［13］研究不同分子质量的聚乙烯微塑料对小麦农艺性状的影响发现，微塑料累积会显著降低小麦的千粒重，且与分子质量大小密切相关，其中5000 D分子质量的聚乙烯微塑料影响最为显著.
图1
图1
空白（CK）、147 mg·kg-1微塑料（L）和782 mg·kg-1微塑料（H）处理组下小麦籽粒和秸秆的生物量
Data are means of three replicates ± standard deviation.
Different letters among bars indicate statistically significant difference at p≤0.05.
Fig.1
The grain and shoot biomass from wheat grown in the CK (control)，L (147 mg·kg-1 microplastic) and H (782 mg·kg-1 microplastic) treatment
2.2 微塑料对土壤理化性质的影响
不同处理组土壤的理化性质分析结果显示施加微塑料显著降低土壤有机质、阳离子、总磷和有效磷含量（表1）.与对照相比，147 mg·kg-1微塑料处理下，土壤有机质含量降低33.9%，而782 mg·kg-1微塑料处理下，降低35.8%，低、高浓度组间并无显著差异.147 mg·kg-1微塑料处理下，CEC下降2.6%，而782 mg·kg-1微塑料处理下无显著差异.与本研究结果不同的是，向黄绵土中添加聚丙烯微塑料，发现添加微塑料的土壤溶解性有机质（DOC，dissolved organic matter）含量显著增加，在第30 d，高浓度微塑料组由于刺激了FDA（fluorescein diacetate）水解酶的活性，导致微生物对土壤有机质或DOM（dissolved organic matter）的水解活性增强，DOC含量相较于CK增加了35.0%，促进了土壤养分向土壤溶液的释放和DOM的积累［16］.Kim et al［17］研究线虫对土壤聚苯乙烯微塑料的响应时观察到CEC和黏土含量是影响530 nm聚苯乙烯颗粒毒性的主要因素，线性模拟发现黏土含量越高，微塑料产生的毒性越大.由此猜测微塑料的添加会降低土壤有机质含量和CEC，同时使得微塑料毒性的降低.
表1 空白（CK）、147 mg·kg-1微塑料（L）和782 mg·kg-1微塑料（H）处理对土壤化学性质的影响（0~15 cm）
Table 1
| 处理 | pH | CEC (cmol·kg-1) | 有机质 (g·kg-1) | 全氮 (g·kg-1) | 全磷 (g·kg-1) | 有效磷（mg·kg-1） |
|---|---|---|---|---|---|---|
| CK | 6.75±0.12 a | 49.69±0.19 a | 27.30±4.87 a | 0.68±0.11 a | 1.03±0.07 a | 34.53±1.23 a |
| L | 6.63±0.15 a | 48.41±0.20 b | 18.05±0.58 b | 0.54±0.04 a | 0.87±0.09 b | 26.75±0.20 b |
| H | 6.77±0.02 a | 45.94±4.74 ab | 17.54±0.66 b | 0.54±0.07 a | 0.82±0.06 b | 21.39±0.38 c |
Data are means of three replicates ± standard deviation.Different letters among bars indicate statistically significant difference at p≤0.05.
本研究中，随着微塑料浓度的升高，土壤总磷和有效磷含量显著下降（表1）.与对照相比，低浓度和高浓度微塑料处理下土壤总磷分别降低了15.4%和20.5%，有效磷分别降低了22.6%和38.1%.土壤磷酸酶活性改变分析结果如图2所示，与空白组相比，147 mg·kg-1微塑料显著抑制了土壤磷酸酶活性，而782 mg·kg-1微塑料处理无显著性差异.土壤磷酸酶的活性直接影响土壤中磷的有效性，有机磷经过土壤磷酸酶的酶促作用，转化为有效磷.在稻田中，观察到PVC（polyvinyl chloride）微塑料对有效磷有负面影响，添加1% PVC微塑料可将有效磷含量从38.4 mg·kg-1降低至26.9 mg·kg-1［18］.本实验中发现聚乙烯微塑料降低了土壤养分，改变土壤酶.
图2
图2
空白（CK）、147 mg·kg-1微塑料（L）和782 mg·kg-1微塑料（H）处理组下酸性、中性和碱性磷酸酶活性
Data are means of three replicates ± standard deviation.
Different letters among bars indicate statistically significant difference at p≤0.05.
Fig.2
Activities of the acid,neutral,alkaline phosphatase in soil in the CK (control)，L (147 mg·kg-1 microplastic) and H (782 mg·kg-1 microplastic)
2.3 微塑料对土壤团聚体稳定性的影响
添加微塑料半年后，不同深度土壤水稳定性团聚体分布如图3所示.团聚体分为小于0.25 mm，0.25~0.5 mm，0.5~1 mm，1~3 mm，大于3 mm等不同尺寸，小于0.25 mm称为微团聚体，大于0.25 mm为大团聚体［19］.与对照组相比，0~10 cm土壤中低、高浓度微塑料处理组下土壤微团聚体含量分别降低了5.6%和8.2%，10~20 cm土壤中分别增加了9.3%和7.1%，20~30 cm增加了15.0%和25.7%.结果表明微塑料可显著增加深层土壤微团聚体的含量，并且微团聚体含量的增加与微塑料浓度相关.土壤团聚体是土壤的重要组成部分，是土壤结构的基本单位，其形成和稳定主要是通过土壤中各种胶结物质的胶结作用实现的.对中国西南地区土壤样品中微塑料的分布研究发现72%的微塑料与土壤团聚体有关，而在微团聚体中发现的纤维塑料颗粒最多［20］.类似的研究发现分别暴露于1 g·kg-1聚乳酸微塑料和1 g·kg-1高密度聚乙烯微塑料的土壤均发生宏观团聚体（>2000 μm）减少而63~250 μm的微小团聚体增加［11］.微团聚体结合在一起形成大团聚体，微团聚体内部的键强于微团聚体之间的键［21］.微团聚体的增加可能是因为添加的微塑料改变土壤的物理性质，增强形成团聚体的颗粒之间的内聚力，而微塑料的存在降低了微团聚体之间的聚集.土壤团聚体剖面的变化可能会导致微观和宏观团聚体中土壤碳过程和相关养分的利用率发生变化，对土壤中其他生物物理过程具有潜在的连锁影响［22］.
图3
图3
对照组、低浓度微塑料（147 mg·kg-1）和高浓度微塑料（782 mg·kg-1）处理下不同深度土层土壤结构
Fig.3
Soil structure at different depths (0~10，10~20，20~30，30~40 cm) in the control,147 mg·kg-1 microplastic and 782 mg·kg-1 microplastic treatment (Data are means of three replicates)
2.4 土壤微生物与土壤养分指标的相关关系
表2 空白（CK）、147 mg·kg-1微塑料（L）和782 mg·kg-1微塑料（H）处理土壤样本中细菌丰富度和多样性指数
Table 2
| 处理 | Shannon指数 | Simpson指数 | Ace指数 | Chao指数 |
|---|---|---|---|---|
| CK | 6.46±0.10a | 0.0069±0.0017a | 3203.57±109.82a | 3248.18±123.73a |
| L | 6.46±0.16a | 0.0086±0.0041a | 3248.95±98.34a | 3242.02±96.10a |
| H | 6.38±0.12a | 0.0093±0.0029a | 3172.73±92.24a | 3180.54±116.97a |
Data are means of three replicates ± standard deviation. Different letters among bars indicate statistically significant difference at p≤0.05.
对土壤微生物群落结构和土壤养分指标（包括土壤有机质、全氮、铵态氮、硝态氮、全磷、有效磷、速效钾等）的冗余分析（RDA，redundancy analysis）结果如图4所示.RDA1和RDA2分别可以解释提取排序轴的51.1%和19.6%.冗余分析的优点是能够直观地解释不同环境的关系，并且展示环境因子和样本之间的关系.箭头越长表示某一土壤因子对样本的影响越大.由图4看出，土壤速效钾，有效磷，总磷影响着处理组间土壤微生物群落结构分布，其中有效磷、速效钾与RDA第一排序轴呈正相关.类似的研究发现在酸性红壤中添加0.1%和1% DEHP（bis（2⁃ethylhexyl） phthalate）增塑的PVC微塑料后，土壤有效磷浓度增加，同时土壤微生物中三个OTU的相对丰度显著增加，而这三个OTU的相对丰度总和与土壤有效磷含量呈显著正相关［18］，表明OTU的增加可能是造成土壤中有效磷升高的原因.
图4
图4
土壤养分指标（TP,AK,AP,TN,OM,TN,NH3_N,NOx_N）与不同处理组中属水平上微生物的冗余分析
TP:total phosphorus,AK:available potassium,
AP:available phosphorus,TN:total nitrogen,
NH3_N:ammonium nitrogen,NOx_N:nitrate nitrogen
low：147 mg·kg-1 microplastic treatment,
high：782 mg·kg-1 microplastic treatment.
Fig.4
Redundancy analysis (RDA) based on the relative abundances of bacterial genus and soil nutrient indexes
为评估微生物与土壤养分指标之间的相关性，对目水平的丰度在前20（TOP20）的微生物和七种土壤养分指标进行spearman相关性分析（见图5）.结果显示目水平上，有效磷、全氮、有机质和铵态氮等土壤理化指标与TOP20具有相关关系，其中与有效磷相关的微生物共九个，占比45%，与总氮、有机质和铵态氮相关的微生物分别有三个、两个和一个.与有效磷相关的微生物包括Burkholderiales，Clostridiales，Gemmatimonadales，Microtrichales，RBG⁃13⁃54⁃9，Rhizobiales，SBR1031，Solirubrobacterales和Sphingomonadales，其中Burkholderia是一种植物生长促生菌（PGPR），可以定殖在作物根部，增加产量，控制疾病［24］.Burkholderiales可以解磷，将土壤中难溶性或不溶性的磷转化为易于被植物吸收利用的磷［25］，与研究中该菌与有效磷具有相关关系的结果一致.Clostridiales对土壤中碳循环有重要作用［26］.Gemmatimonadales与土壤有机物质有强相关关系，与作物的碳同化有关［27］.除此以外，Gemmatimonas是聚磷微生物［28］.Microtrichales可以产生生物活性的化合物，有助于矿化有机质，促进营养物质的循环利用［29］.Rhizobiales是根瘤菌，可以通过共生固氮作用将空气中游离态氨转化为植物可利用态氮.此外，根瘤菌也有分解难溶性磷酸盐或难溶性有机磷的能力［30］.SBR1031的代谢功能与氨氮有关［31］.Sphingomonadales与土壤污染有关，多环芳烃的污染会使该微生物丰度增加［32］.与有效磷的结果相联系可推测聚乙烯微塑料能够降低土壤中与有效磷相关的微生物丰度，进而影响土壤有效磷总磷含量，改变土壤养分循环，作物生长.
图5
图5
土壤养分指标与不同处理组中目水平上微生物的spearman相关性分析
*表示0.01<p≤0.05，**表示0.001<p≤0.01
Fig.5
Spearman correlation analysis based on the relative abundances of bacterial orders and soil nutrient indexes
3 结 论
本文利用野外lysimeter试验研究聚乙烯微塑料在野外土壤中对土壤⁃小麦系统的影响.结果表明添加聚乙烯微塑料对小麦的生长无显著影响.与空白组相比，聚乙烯微塑料显著改变了土壤理化性质，包括降低土壤有机质、CEC、总磷和有效磷含量，显著增加土壤微团聚体比例，并且微团聚体含量的增加与微塑料浓度相关.聚乙烯微塑料不足以引起土壤微生物群落组成的显著变化，但相关性分析结果显示土壤养分指标与丰度微生物具有相关性，其中与土壤有效磷具有正相关关系的微生物占比最多，推测微塑料能够改变土壤中与有效磷相关的微生物，进而影响土壤有效磷总磷含量.关于聚乙烯微塑料对土壤微生物和养分循环过程的影响仍需要进一步的研究.
参考文献
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Evidence of microplastic accumulation in agricultural soils from sewage sludge disposal
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Mini⁃review of microplastics in the atmosphere and their risks to humans
Polyethylene and biodegradable mulches for agricultural applications：A review
Polymer⁃specific modeling of the environmental emissions of seven commodity plastics as macro⁃ and microplastics
Role and management of soil biodiversity for food security and nutrition
Bacterial and fungal contributions to carbon sequestration in agroecosystems
Microplastic transport in soil by earthworms
Impacts of microplastics on the soil biophysical environment
Effects of microplastics in soil ecosystems：Above and below ground
Microplastics can change soil properties and affect plant performance
微塑料对小麦农艺性状及氮素利用效率的影响
Effects of microplastics on agronomic characters and nitrogen utilization efficiency of wheat
微塑料对小麦生长及生理生化特性的影响
Effects of microplastics on the growth，physiology，and biochemical characteristics of wheat (Triticum aestivum)
Microplastics in aquatic environments：occurrence，accumulation，and biological effects
Response of soil dissolved organic matter to microplastic addition in Chinese loess soil
Size⁃dependent effects of polystyrene plastic particles on the nematode Caenorhabditis elegans as related to soil physicochemical properties
Effect of polyvinyl chloride microplastics on bacterial community and nutrient status in two agricultural soils
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Diversity and significance of Burkholderia species occupying diverse ecological niches
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Bacterial rather than fungal community composition is associated with microbial activities and nutrient⁃use efficiencies in a paddy soil with short⁃term organic amendments
Gemmatimonas aurantiaca gen
nov，
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不同土壤类型中大豆根瘤菌解磷能力及其稳定性评价
Evaluation of phosphate⁃solubilizing ability and stabi⁃lity of rhizobium fredii in various soils
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