南京大学学报（自然科学版）, 2019, 55(5): 819-824 doi: 10.13232/j.cnki.jnju.2019.05.015

剪切流场中高分子链构象转变的FRET研究

瞿志超, 张俊生, 陈葳,

配位化学国家重点实验室，南京大学化学化工学院高分子科学与工程系，南京，210023

The conformational transitions of polymer chains in shear flow measured by FRET

Qu Zhichao, Zhang Junsheng, Chen Wei,

State Key Laboratory of Coordination Chemistry, Department of Polymer Science and Engineering, School of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing University, Nanjing, 210023, China

通讯作者: E⁃mail:weichen@nju.edu.cn

收稿日期: 2019-04-08   网络出版日期: 2019-09-22

基金资助: 国家自然科学基金.  21790342.  21790345

Received: 2019-04-08   Online: 2019-09-22

摘要

高分子在流动中发生的取向和变形是导致流体产生非线性粘弹性的主要原因.通过荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)光谱技术检测标记在同一根聚苯乙烯（Polystyrene，PS）链上的荧光供体和受体基团间的荧光共振能量转移效率，考察高分子链构象的转变.不同剪切速率下的原位荧光检测结果显示，在剪切流(Couette)场中，随着剪切速率的增加，荧光共振能量转移效率显著上升，表明荧光供、受体基团间的距离减小，意味着PS链在高剪切速率下变形加剧，线团塌缩.FRET还检测到了剪切速率在500 s-1附近时PS的链取向变化行为与剪切速率在1000 s-1附近亚浓溶液中PS链伴随着缠结点保留率的降低而发生的构象变化，表明FRET方法可以灵敏地检测高分子链构象的转变，为高分子流体非线性流变学理论和模拟研究提供直观的实验证据.

关键词： 高分子溶液 ; 剪切流场 ; 构象转变 ; 荧光共振能量转移

Abstract

Since the large deformation of polymers under flow is the source of nonlinear viscoelasticity,understanding the conformational changes of polymeric chains in solutions is an essential and integral part of polymer physics. A fluorescence resonance energy transfer (FRET) technique,which is considered as a “spectroscopic ruler” for characterizing the distance between fluorescent donor and acceptor,has been applied to measure the FRET efficiency between donor and acceptor labeling on single polymer molecules in shear flow (Couette flow). Chromophore pairs are grafted randomly onto polystyrene (PS) chains,and real⁃time rheo⁃fluorescence measurements on polymers in solution,a PS system of dilute and semidilute solution,are reported at different shear rates. The PS in Couette flow shows a systematic increase of FRET efficiency at high shear rate,which indicates the decrease of distances between fluorescent donor and acceptor chromophores,corresponding to a deformation of the polymer molecules with shear exposure. The conformational transitions of PS,such as the orientation of chains at a shear rate around 500 s-1,have also been detected by FRET. These results indicate that FRET is sensitive for the detection of conformational transitions of polymer chains. FRET technique provides direct experimental evidence for the theory and simulation researches of nonlinear rheology of polymers.

Keywords： polymer solution ; shear flow ; conformational transition ; fluorescence resonance energy transfer

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本文引用格式

瞿志超, 张俊生, 陈葳. 剪切流场中高分子链构象转变的FRET研究. 南京大学学报（自然科学版）[J], 2019, 55(5): 819-824 doi:10.13232/j.cnki.jnju.2019.05.015

Qu Zhichao, Zhang Junsheng, Chen Wei. The conformational transitions of polymer chains in shear flow measured by FRET. Journal of nanjing University[J], 2019, 55(5): 819-824 doi:10.13232/j.cnki.jnju.2019.05.015

高分子材料加工成型时，处于剪切流场中的高分子链因发生拉伸、取向、解缠等变化而表现出丰富和独特的流动形变特性[1].传统的珠链模型、哑铃模型[2,3]在低剪切速率直至平衡态的行为和线性粘弹性行为等方面得到广泛成功，但高剪切速率下高分子链的非线性粘弹性行为的分子机理仍存在争论，实验中也缺乏灵敏的对剪切场中高分子链构象变化的直接检测手段.

荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)光谱技术提供了一种灵敏检测纳米尺度距离变化的方法[4,5,6].FRET是荧光供体和受体基团之间通过长程偶极作用发生非放射性能量转移的现象[6]，能量转移效率与供体、受体之间距离的关系见式(1)：

E=1+rR06-1

其中，E是荧光共振能量转移效率，r是荧光供体和受体之间的距离，R0是供体和受体的特征距离，仅与选取的荧光供体和受体的种类相关.由式(1)可知，E随着r的增大而下降，在R0附近r的微小变化将引起E的极大改变[7].在荧光测量光谱中FRET的效率E正比于受体和供体基团的荧光峰强度的比值，因此该比值可作为两种生色团之间距离的“光谱尺”.FRET效率在0.5~10 nm随着供体与受体间距离的变化而迅速改变[6]，由于上述敏感距离正好对应大分子聚集行为的转变尺度，所以FRET方法为大分子内部结构和分子间相互作用的测定提供了一条直接、简便、灵敏的途径[8,9].当将荧光供体和受体基团同时标记在同一根高分子链上，便可以通过简单的测量能量转移效率的变化来反映高分子单链整体构象的变化[10,11,12]，这种方法称作分子内FRET光谱法.

Farhangi and Duhamel[8]在聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA,Mn=2.0×105)链末端标记了荧光供体蒽(An)和受体二巯基苯甲酰基(Dithiolbenzoyl).通过分子内FRET光谱法研究发现，在较高的剪切速率作用下，高分子亚浓溶液中链的均方末端距变小了，但该实验体系采用的PMMA溶液的高分子末端距为12.0 nm，明显比荧光供体和受体的特征距离R0(1.34 nm)要大，这在一定程度上限制了FRET实验方法的灵敏度.

针对上述缺陷，本文选择特征距离为2.85 nm的咔唑(Cz)和蒽(An)作为荧光供体和受体[13]，将咔唑基团和蒽基团随机标记在PS链上，采用分子内FRET光谱法研究高分子在剪切流场作用下的链构象转变.

1 实验部分

1.1　药 品

实验使用的药品见表1.

表1   实验药品及其规格和厂家

Table 1  Specifications of materials

序号药品名称规格厂家
1聚苯乙烯分析纯Aldrich（中国）
29⁃蒽醇分析纯阿拉丁试剂（美国）
3氯化锡分析纯阿拉丁试剂（美国）
4咔唑分析纯阿拉丁试剂（美国）
5甲基咔唑分析纯阿拉丁试剂（美国）
6N,N⁃二甲基甲酰胺分析纯百灵威的超干溶剂（中国）
7四氯化碳分析纯

安耐吉的超干溶剂

（中国）

8氯甲基甲醚分析纯西亚试剂（中国）
9十氢萘色谱纯阿拉丁试剂（美国）

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聚苯乙烯Mn=1.23×105 g·mol-1，PDI(Polymer Dispersity Index)=1.59，甲苯需加入钠丝回流除水，二氯乙烷为色谱纯，使用前未经特殊处理.其他试剂均为市售分析纯.

1.2　荧光标记高分子的合成与实验溶液样品的配制

按照Morawetz[7]的方法，对聚苯乙烯进行氯甲基化处理后，加入脱除质子的咔唑和蒽醇，合成链内随机标记(PS⁃An⁃Cz)的聚苯乙烯分子，分子量为1.23×105 g·mol-1.聚合物分子量通过Photon Technology International（PTI）公司的PL⁃GPC 120型凝胶色谱仪测得，流动相为四氢呋喃，流速1.0 mL·min-1.合成产物的荧光基团接枝含量可以通过紫外可见光分光光度计测量，具体参数见表2.

表2   聚苯乙烯样品参数

Table 2  The parameters of PS samples

样品名称

Mn

(g·mol-1)

PDI

咔唑

含量

蒽醇

含量

PS1.23×1051.59--
PS⁃An⁃Cz1.23×1051.590.567%0.565%

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FRET作为一种灵敏的光谱学方法，在配制荧光样品时需将荧光基团浓度控制在较低范围内，避免荧光自吸收效应(self⁃absorption)和荧光重吸收效应(ab⁃absorption)对实验结果产生影响，因此吸光度A的值需控制在0.05之下[14].根据朗伯比尔定律计算可知，荧光标记的PS溶液浓度不能超过0.05 g·L-1.

本研究以十氢萘为溶剂，配制浓度为0.05 g·L-1的链内标记的PS稀溶液.在配制亚浓溶液时，为避免自吸收的影响，在0.05 g·L-1的样品溶液中加入了未标记荧光基团的PS(1.23×105 g·mol-1)样品以提高PS溶液浓度，配制成10.000 g·L-1的亚浓溶液样品.高分子样品溶解后，在检测前需避光静置48 h以上.

1.3　荧光光谱测量

荧光参数设置如下：光谱激发波长294 nm，激发狭缝宽度0.5 nm，发射狭缝宽度1.0 nm，扫描范围300~460 nm，检测温度20 ℃.依据文献[8]在荧光分光光度计基础上搭建了检测设备，定制石英比色皿结构与荧光检测光路如图1所示.

图1

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图1   荧光实验样品池示意图

Fig.1   Schematic diagram of the couette rheofluorescence cell


石英比色皿圆柱形样品槽直径8 mm，石英棒直径6 mm，石英棒可以为1 mm厚的高分子溶液样品提供0~1696 s-1的剪切流场作用.与此同时，荧光分光光度计会实时记录样品产生的荧光信号.

2 结果与讨论

FRET可以灵敏地反映荧光供体和受体间距离的变化[7]，本文把荧光供体咔唑和受体蒽的峰分别简写为Ic和Ia，Ia/Ic的大小则反映了能量转移效率E的大小[9].由式(1)可知，当检测到Ia/Ic增大时，则能量转移效率E增大，荧光供体和受体间距离r减小.

荧光供体咔唑和受体蒽的特征距离R0约为3 nm[13]，由式(1)可知，荧光供体和受体间的距离在1~5 nm范围内FRET才具有很高的灵敏度.本文配制的PS稀溶液浓度远低于临界交叠浓度[10]，因此链间的荧光共振能量转移可以忽略，而加入未标记荧光基团的PS可以进一步屏蔽链间的荧光共振能量转移，所以本文测试的荧光光谱中的荧光信号主要来自单链上的供体和受体的FRET效应.通过分析Ia/Ic的数值变化可以表征出链整体构象的变化.

将浓度为0.05 g·L-1的PS溶液注入图1所示的检测装置中，在不同的剪切速率下，随着剪切时间的增加，Ia/Ic的变化如图2所示.

图2

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图2   0.05 g·L-1的PS溶液剪切时间与Ia/Ic的关系曲线

Fig.2   Plot of Ia/Ic over time for PS solution at 0.05 g·L-1 polymer concentration exposed to different shear rate


由图2可知，随着剪切时间的增加，两个剪切条件下的Ia/Ic值均增大，并在7 min后趋于稳定，体系达到平衡.平衡后Ia/Ic数值波动很小，数据标准差只有4.2171×10-4和8.8447×10-4，如果取7 min后数据的平均值作为该剪切条件下的Ia/Ic值，那么误差均小于0.2%.因此，对剪切作用7 min后的五个数据取平均值，测得了聚苯乙烯亚浓溶液(10.000 g·L-1)和稀溶液(0.05 g·L-1)在不同剪切速率作用下的Ia/Ic数据，如图3所示.

图3

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图3   (a) 10.000 g·L-1链内随机标记PS溶液Ia/Ic与剪切速率的关系；(b) 0.05 g·L-1链内随机标记PS溶液Ia/Ic与剪切速率的关系

Fig.3   (a) Plot of Ia/Ic for PS solution at 10.000 g·L-1 polymer concentration exposed to different shear rate，(b) plot of Ia/Ic for PS solution at 0.05 g·L-1 polymer concentration exposed to different shear rate


由图3a可知，PS亚浓溶液在剪切速率大于1150 s-1后，Ia/Ic随着剪切速率的提高明显增大，这支持了Chan et al[10]的实验结论，即在较大剪切速率下，剪切流场使得高分子线团变形塌缩，且剪切速率越高，这种变化越明显.

根据Rouse[3]和Kuhn[2]的理论模型，高分子构象转变产生的熵弹力、剪切应力与链尺寸参数关系如下：

felastic(r)=3KbTrNb2
fhyd(R)=6πηxγ˙Rsin2θ

其中，Kb是波尔兹曼常数，T是温度，N是自由链段数，b是自由链段长度，r是高分子链末端距，γ˙是剪切速率，哑铃模型的珠间距离为R(r的线性函数)，它与剪切方向的夹角为θ，η是半径为x的珠的粘度.由式(2)和式(3)可知，剪切应力和熵弹力都是r的线性函数，高分子溶液体系在剪切流场作用下达到平衡时，剪切应力与高分子熵弹力相等.因此，剪切速率增大时，剪切应力随之增大，则平衡状态下高分子构象的转变越大.

根据上述模型，剪切流场中链的尺寸变化与取向也是相关的[2]，由式(3)可知，链在θ为π4方向时发生最大拉伸，在-π4方向时发生最大压缩(图4a).链在剪切流场作用前后的构象转变如图4b和图4c所示，链发生了变形和取向，流体力学半径(RH)减小.

图4

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图4   (a)剪切流场中哑铃模型链构象变化预测[10]；(b)静止状态链的构象示意图；(c)高剪切流场中链的构象示意图

Fig.4   (a) Model of polymer bead-chain in a velocity gradient[10],(b) schematic of the conformation of PS in semidilute solution before shear，(c) schematic of the conformation of PS in semidilute solution at high shear rate


偏振实验表明，剪切流场中链取向在小于500 s-1时与剪切方向平行，大于500 s-1时与剪切方向垂直[15,16].通过FRET实验同样观察到了这一转变(图3a)，在500 s-1附近出现了极值.同时，图3a在1000 s-1处也出现了一个极值.刘冬梅等[17]通过理论计算模拟，发现当剪切速率大于1τd(τd为松弛时间)时，高分子溶液缠结点数量会减少，链被拉伸.根据PS溶液的浓度与分子量可以估算出良溶剂中链的τd是毫秒级的[15]，因此剪切速率大于1000 s-1后Ia/Ic有所下降是高分子缠结点数量减少、链拉伸的结果.

图3b显示，PS稀溶液在较高的剪切速率下，剪切流场同样会使链发生变形和取向，流体力学半径减小，这与Dunstan and Wei[16]对极稀溶液中孤立高分子线团在高剪切流场作用下模拟预测的行为一致.同时，因为在高分子稀溶液中，链彼此分离，没有缠结，所以对比图3a，图3b中Ia/Ic的值在剪切速率大于1000 s-1时迅速增大，没有极值，且500 s-1附近的极值也出现得更早.这说明高分子亚浓溶液中链间的缠结与相互作用使得链在剪切流场中的变形和取向更难发生.

3 结 论

本研究用分子内FRET光谱技术实时检测剪切流场中高分子链的取向和变形行为.实验结果表明，在高剪切速率下高分子线团变形塌缩，变形程度随剪切速率的提高而明显增大.由于选用的测量体系FRET灵敏度非常高，还检测到剪切速率在500 s-1附近高分子链因取向而发生的构象转变，剪切速率在1000 s-1附近亚浓体系中高分子链伴随着缠结点保留率的降低而发生的构象转变.这些检测结果为数值模拟研究的结果提供了直接的实验证据.根据高分子链在变形的同时产生取向、流体力学半径减小的理论推导，本文还给出了高分子线团在较大剪切速率下的变形和取向的分子图像.

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